NISIN – CHẤT BẢO QUẢN CÓ NGUỒN GỐC TỰ NHIÊN

Nisin là một bacteriocin được sinh tổng hợp bởi một số chủng vi khuẩn Lactococcus lactis. Lịch sử nghiên cứu nisin đã trải qua gần một thế kỉ, bắt đầu vào năm 1928, khi lần đầu tiên nisin được phát hiện ra. Năm 1928, Rogers và Whittier là người đầu tiên công bố về tác động ức chế của nisin sinh ra do Streptococcus lactis (hiện nay được gọi là Lactococcus lactis sbusp. lactis) đối với Lactobacillus bulgaricus.

Nisin không độc, không kích thích tăng trưởng, có hoạt tính chống Clostridiumnên hiện nay, nisin trở thành chất bảo quản thực phẩm hiệu quả. Từ những năm 1951, Hirsch và một số tác giả khác bắt đầu kiểm tra khả năng ứng dụng của nisin trong thực phẩm. Hirsch đã chứng minh việc sử dụng chủng vi khuẩn lactic sinh nisin làm giống khởi động có thể ngăn chặn sư hư hỏng phomat gây ra bởi Clostridium butulium. Cũng trong thời gian đó nhiều nhà nghiên cứu khác đã sử dụng chủng vi khuẩn sinh nisin vào quá trình lên men phomat để ức chế sự lên men butyric của các vi khuẩn gây hư hỏng.

Năm1957, hãng Apilin và Barrett đã đưa ra chế phẩm thương mại nisin sử dụng trong thực phẩm. Dạng chế phẩm nisin sẵn có nhất hiện nay trên thị trường đó là NisaplinTM, với thành phần 2,5% nisin.

Năm 1969, tổ chức FAO và WHO chính thức công nhận nisin là an toàn và cho phép sử dụng như chất bảo quản thực phẩm với liều lượng 400IU/g. Năm 1988, chính thức được tổ chức FDA của Mỹ công nhận là an toàn và coi là chất bảo quản có nguồn gốc sinh học. Hiện nay, nisin được sử dụng ở trên hơn 50 quốc gia.

Cấu trúc phân tử Nisin

Cấu trúc hoàn thiện của nisin được làm sang tỏ bởi Gross và Morell vào những năm bảy mươi của thế kỉ XX. Sau đó, có ít nhất 6 loại nisin được phát hiện và  được xác định tính chất (6 loại nisin được ký hiệu là A, B, C, D, E và Z), trong đó nisin A là dạng hoạt động nhất. Trong tự nhiên có 2 nisin bền là A, Z. Chúngkhác nhau ở vị trí aa thứ 27, histidin đối với nisin A và aspartic đối với nisin Z. Công thức tổng quát của nisin là C143H230N42O37S7.

Hình 1. Cấu trúc phân tử nisin.

Phân tử nisin bao gồm 34 axit amin trong đó có 1 số là axit amin đã cải biến. Những cải biến đó là sự khử nước ởxerin và threonin, tạo ra axit amin không no là dehydroalanin (DHA) và axit amin dehydrobutyrin (DHB). Các axit amin này liên kết với các axit amin khác thông qua cầu lưu huỳnh, tạo thành 5 vòng đặc trưng. Năm nội vòng phân tử được tạo bởi các liên kết thioete. Trong đó vòng A 3-7, Ala-S-Ala là lanthionine, còn 4 vòng B,C,D,E tương ứng 8-11, 13-19, 23-26, 25-28 là các β- metyl lanthionine. Các vòng A, B, C sẽ hợp lại thành nhóm ngăn cách với nhóm còn lại gồm 2 vòng D và E thông qua axit amin thứ 21 đóng vai trò như một “bản lề”.

Phân tử nisin có thể tồn tại ở dạng monome với khối lượng phân tử 3500 Da. Do các phân tử nisin có thể tương tác liên kết với nhau thông qua các nhóm axit dehydroamin và các nhóm amin nên nisin có thể tồn tại ở dạng dime hay tetrame với khối lượng phân tử tương ứng là 7000Da và 14000 Da.

Những thành tựu nghiên cứu sinh học phân tử gần đây chứng minh nisin bao gồm một số peptit có tính kháng khuẩn, một sản phẩm dị gen bao gồm 11 gen: Nis A, Nis B, Nis T, Nis C, Nis I, Nis P, Nis R, Nis K, Nis F, Nis E, Nis Z.

 


Hình 2: Hình ảnh cấu tạo của một số phân tử nisin.

Một số tính chất của nisin

Ø Độ hòa tan

Nisin bản chất là một peptit mang điện tích dương nên độ hòa tan phụ thuộc vào pH của dung dịch. Ở pH=2,2 độ hòa tan 56mg/ml; ở pH=5,0 là 3 mg/ml và ở pH =11 là 1 mg/ml. Nisin hòa tan ở pH=3 sau khi đun nóng ở 115 0C trong 20 phút vẫn giữ được hoạt động mạnh nhất (97,5%). Ở mức pH khác, hoạt động của nisin giảm. Ở pH=7 trong điều kiện nhiệt độ phòng nisin ngừng hoạt động. Nisin biến đổi trong quá trình bảo quản và dễ bị bất hoạt bởi các enzyme phân giải protein ở pH=8. Enzyme nisinase của Steptococcus thermophilus, Lactobacillus plantarum, vi khuẩn lactic và một số loài Bacillus làm bất hoạt nisin.

Ø Độbền nhiệt

Nisin là một bacteriocin bền nhiệt. Hoạt tính của nó gần như không đổi ở nhiệt độ 4-10oC, ở 30-60oC sau 30 phút vẫn giữ được 80-90% hoạt tính ban đầu. Từ 80oC trở lên, hoạt tính bắt đầu giảm mạnh, sau 60 phút ở 100oC vẫn còn 50% hoạt tính. Ở 121oC, sau 10 phút hoạt tính còn 46%, sau 60 phút còn 22%. Độ bền nhiệt của nisin cũng phụ thuộc vào pH, pH càng thấp thì độ bền nhiệt càng cao. Trong quá trình bảo quản thực phẩm, hoạt tính nisin cũng bị giảm, đặc biệt khi nhiệt độ và pH cao. Tuy nhiên, nisin vẫn có thể bền sau 30 tuần trong phomat với pH=5,8 và nhiệt độ 20oC.

Ø Tính chất kháng khuẩn

Nisin có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn Gram dương: Alicyclobacillus, Bacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, Pediococcus, Staphylococcus và Sporolactobacillus (Hawley, 1957, công ty trách nhiệm thực phẩm Aplin và Barrett). Hiệu quả tác dụng của nisin rất nhanh, biểu hiện ở mức độ của chủng bị tấn công giảm nhanh sau vài phút có mặt nisin. Tác dụng của nisin lên tế bào tại pha sinh trưởng thường mạnh hơn rất nhiều so với tế bào ở pha cân bằng. Do có sự phá vỡ các tổ chức cục bộ trên màng tế bào nhạy cảm với nisin sau đó phá vỡ màng tế bào, xâm nhập vào tế bào chất và làm chết tế bào vi sinh vật đó.

Ø Phổ kháng khuẩn

Nisin không có khả năng ức chế và tiêu diệt vi khuẩn Gram âm, nấm men, nấm mốc. Điều này được giải thích là do sự khác nhau giữa thành tế bào vi khuẩn Gram dương và Gram âm. Bacteriocin chỉ tạo ra lỗ thủng trên thành tế bào Gram dương mà không ở tế bào Gram âm.Giá trị quan trọng của nisin được thế hiện ở tác dụng ức chế các vi khuẩn sinh bào tử như Clostridium và Bacillus, các tác nhân chính gây hư hỏng thực phẩm. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh nisin có thể ngăn chặn sự phát triển bào tử Clostridium botulium loại A, B, E.

Cơ chế tác động của nisin

Hoạt động của nisin bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố môi trường: pH, kích thước vi sinh vật, và sự tương tác với các thành phần thực phẩm. Hoạt động của nisin tăng lên cùng với việc giảm pH và giảm số lượng ban đầu vi sinh vật. Sự có mặt của các thành phần thực phẩm như chất béo và protein ảnh hưởng tới hoạt động của nisin. Nisin chống lại L.monocytogenesinkém hơn trong sữa và trong kem  do nồng độ chất béo tăng. Điều này có thể giải thích là do liên kết của nisin với các hạt cầu béo. Được khắc phục bằng cách thêm chất nhũ hóa (ví dụ Tween 80). Thomas và cộng sự (1998) đã chứng minh rằng ester của đường và axit béo (sucrose, palmitate và sucrose stearat) là chất nhũ hóa tăng cường hoạt động của nisin chống lại Bacillus cereus, Listeria monocytogen, Lactobacillus plantarum và Staphylococcus aureus, nhưng không ảnh hưởng nào đến hoạt động của nisin trong việc chống lại các vi khuẩn gram âm.

Nisin tác động chủ yếu lên màng tế bào chất của tế bào sinh dưỡng của vi sinh vật. Cơ chế hoạt động của nisin là tạo thành các lỗ trên màng tế bào làm giảm động lực proton, làm thất thoát các ion tự do, axit amin và ATP. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng khi bổ sung nisin vào các tế bào nhạy cảm (Staphylococcus cohnii, Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Streptococcus zymogenes) số lượng axit amin cũng như số lượng các ion RB+ và K+ trong tế bảo giảm mạnh. Ngoài ra nisin còn ngăn cản việc hấp thu proline và glutamine của các túi màng ở các tế bào này. Sự mất mát các ion này dẫn đến việc giảm nhanh chóng chênh lệch hiệu điện thế màng, Δ . Những ảnh hưởng của nisin đến thành phần proton, Δ , ΔpH, đã được kiểm chứng trên L.monocytogenes. Ngoài ra, việc sử dụng nisin cũng làm giảm lượng ATP dự trữ của tế bào.

Tác động của nisin với năng lượng tế bào phù hợp với cơ chế hình thành lỗ màng tế bào chất. Sahl và cộng sự (1987) phát hiện thấy nisin tạo thành các lỗ có đường kính 0,2 –1nm trên màng lipid màu đen (màng nhân tạo Δ  ) chỉ cho phép các chất hòa tan lớn cỡ 500Da trở xuống đi qua. Garcera và cộng sự (1993) cho rằng nisin tạo thành lỗ hổng trên màng giống như các kênh ngăn chặn (barrel-stave ) theo 3 bước: (1) các monome nisin tạo liên kết với một màng mục tiêu, (2), nisin chèn vào màng, (3) các phân tử nisin tổng hợp để tạo thành lỗ hỏng trên màng tế bào chất. Các phân tử nisin cũng có thể tổng hợp trước khi chèn vào màng tế bào.


Hình 3: Cơ chế phá hủy của lớp I bacteriocins.

Lớp I bacteriocins, như nisin, có một cơ chế kép trong việc tiêu diệt các tế bào mục tiêu thông qua:  (a) ức chế tổng hợp vách tế bào và (b) hình thành lỗ hỏng. Cả hai cơ chế được tạo điều kiện bởi sự liên kết của các phân tửnisin với lipid II.  Ở nồng độ thấp, nisin ngăn chặn sự tổng hợp thành tế bào thích hợp, dẫn đến chết tế bào. Ở nồng độ cao, nisin liên kết với lipid II, chèn vào màng tế bào và hình thành lỗ hỏng, dẫn đến sự rò rỉ của các thành phần tế bào như các ion và ATP.

Ứng dụng của nisin hiện nay

Nisin được sử dụng rộng rãi như là một chất bảo quản trong ngành công nghiệp thực phẩm. Đồng thời nó có tiềm năng để sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe như kem đánh răng và các sản phẩm chăm sóc da. Nisin là một peptide bao gồm 34 axit amin được tạo ra bởi các chủng vi khuẩn Lactococcus lactis subsp. Lactis, nó có khả năng chống lại vi khuẩn gram dương. Nisin được sản xuất dưới dạng sản phẩm thương mại và đã được sử dụng như là một chất bảo quản sinh học trong các sản phẩm sữa và thịt. Tại Hoa Kì, nisin được công nhận là an toàn (GRAS) và được cho phép để sử dụng trong quá trình chế biến một số loại phomat nhằm ngăn chặn sự bùng phát của bào tử clostridial và các loại sinh độc tố. Ngoài ra, nisin còn được sử dụng để làm bất hoạt các vi sinh vật ưa nhiệt gây hư hỏng thực phẩm đóng hộp và mở rộng thời hạn sử dụng của các sản phẩm làm từ sữa và sữa. Nisin có hoạt tính kháng khuẩn chống lại một loạt các vi khuẩn Gram dương nhưng nó lại có ít hoặc không có hoạt tính chống vi khuẩn Gram âm, nấm men và nấm mốc. Sự hình thành bảo tử của vi khuẩn Gram dương thuộc các giống Bacillus, Clostridium ssp. đặc biệt nhạy cảm với nisin, bào tử nhạy cảm với nisin hơn các tế bào sinh dưỡng. Với phổ kháng khuẩn như vậy, nisin đã được sử dụng như là một chất bảo quản thương mại trong các sản phẩm mà quá trình sản xuất chúng không thể hoàn toàn tiệt trùng bằng nhiệt độ cao mà chỉ được khử trùng bằng phương pháp pasteur. Nisin cũng có hoạt tính chống lại vi khuẩn sinh axit lactic. Vi khuẩn này thường sinh trưởng ở pH thấp, do đó nisin có thể được sử dụng như một chất bảo quản trong thực phẩm có pH thấp mà không phải xử lý bằng nhiệt, chẳng hạn dầu trộn salad, rượu và đồ uống.